別誤殺了豬！非洲豬瘟熒光定量PCR檢測常見假陽性結果分析
發布時間：2021-08-29 瀏覽次數：4704次
指導策劃：仇華吉
支持媒體：豬易傳媒
非洲豬瘟疫情發生兩年多以來，養殖從業人員對于非洲豬瘟疫情的認識從最初的漠不關心，到談非色變，如今多數豬場已經找到了防控非洲豬瘟的辦法，發現非洲豬瘟可防可控，并不可怕。目前，養豬業通過精準檢測發現病原，同時有效執行生物安全措施使得非洲豬瘟防控取得了可喜的進展，可有效遏制疫情發生和蔓延。
非洲豬瘟在我國暴發之初，養殖從業人員對于生物安全管理存在畏難心理，對非洲豬瘟病毒了解不夠，普遍認為生物安全太難，無法有效執行。發生非洲豬瘟后，精準清除執行不到位，以至于幾乎全軍覆沒，損失慘重。從今年很多豬場的經驗來看，生物安全真正落實到位是可行且行之有效的。另外，選擇敏感、穩定、性能優異的檢測方法，結合有效的阻斷措施后，精準清除的成功率非常高。
從筆者走訪的豬場所了解的一些案例來看，精準清除失敗主要存在兩大原因：生物安全措施執行不到位；檢測系統不科學。
非洲豬瘟診斷目前最有效、使用最多的方法是熒光定量PCR檢測。熒光定量PCR檢測系統由熒光定量PCR儀、熒光定量PCR檢測試劑和耗材、核酸提取儀、核酸提取試劑和耗材等組成。設備、試劑和耗材選擇和搭配不當，可能導致檢測結果不準確。
熒光定量PCR是一種非常敏感的檢測方法。實驗室經常開展檢測工作，一旦實驗室管理和環境控制沒有執行到位，就存在由于交叉污染出導致假陽性的風險，進而帶來臨床上誤殺豬只的嚴重后果。下面，分析了一些常見的熒光定量PCR實驗室假陽性情況供大家參考。
一
熒光定量PCR檢測出現假陽性的常見原因
1. 實驗室污染是導致假陽性結果的主要原因
非洲豬瘟野毒感染時血液和組織中病毒載量非常高，經常檢測到Ct值15左右的樣本。樣本處理和提取的過程中需要進行離心操作，這些高濃度的樣本離心時容易造成氣溶膠污染。對于血液和組織樣本，檢測非洲豬瘟病毒應該盡可能減少離心操作，這類樣本病毒載量高、樣本較純凈，可以采用免提取檢測。
實驗室如果長期檢測陽性樣本，擴增產物中高濃度的目的片段很容易擴散到空氣中并不斷累積導致氣溶膠污染。
核酸自動提取儀可顯著提高實驗效率，然而，養殖企業實驗室大多使用中小型核酸自動提取儀，并且沒有適當的防污染措施，在樣本處理過程中可能出現交叉污染。相對于氣溶膠污染，樣本處理過程中交叉污染導致的假陽性概率較小。
2. 熒光定量PCR試劑盒污染或者非特異性反應
某些試劑盒沒有在GMP車間進行生產，或者GMP車間生產過程中車間潔凈度不夠或人員操作不規范，在試劑盒生產過程中可能出現陽性核酸片段或者質粒污染反應體系的情況。
某些試劑盒生產工藝不過關，可能出現非特異性翹尾現象。
試劑盒中引物、探針等原料品質不過關，質量控制不嚴格，也可能導致非特異性反應。
3. 熒光定量PCR儀性能不佳導致翹尾
筆者發現某些熒光定量PCR儀性能不佳，在反應后期出現非特異性翹尾峰。
4. 電壓不穩導致的基線不穩定
很多養殖企業將實驗室設置在豬場附近，使用電源大多是農用電，電壓不穩定，會導致擴增基線不穩定。另外，豬場附近的臨床實驗室停電風險相對較高。建議這些實驗室配備UPS緊急電源。
5. 樣本或者氣泡干擾
反應體系中存在氣泡或者某些樣本含有特殊成分可能干擾實驗，產生非特異性擴增曲線，這種擴增曲線通常不呈現典型的S型擴增曲線形態。
二如何降低實驗室污染和假陽性？
實驗室質量管理的關鍵要素通常離不開人、機、料、法、環，保證實驗室質量，減少實驗室污染也離不開這幾個要素。
1. 加強人員培訓，養成良好的實驗習慣，建立有效的溝通和激勵制度
實驗室質量管理最核心的要素是人，必須培養良好的實驗操作和衛生習慣；
熒光定量PCR實驗室分試劑配制區、樣本處理區、核酸擴增區，嚴格分區管理；
不同區域的移液器用不同的標識區分，防止混用；
不同區域使用不同顏色的實驗服區分，防止混穿；
不同區域的耗材、垃圾桶、銳器盒、抹布、拖把不混用；
實驗完成后使用84消毒液擦拭地面、臺面及移液器等；
實驗完成后使用紫外消毒車0.5m左右照射臺面30min；
嚴禁在實驗室打開擴增后的熒光定量PCR管，嚴禁在實驗室區域對擴增后的熒光定量PCR產物進行高壓滅菌或者加熱處理。
2. 選擇性能良好的核酸提取儀和熒光定量PCR儀
大型的全自動化核酸提取儀設計時會引入分區設計、紫外防污染、層流防污染等措施，在選購核酸自動提取儀時應該考慮儀器的防污染性能。可以通過陰陽性樣本交叉擺放，同時提取最大檢測量的樣本，來評估核酸提取儀的防污染性能。
關于熒光定量PCR儀的選擇，某些儀器熱蓋設計存在嚴重缺陷，擴增結束后液體揮發嚴重，大量擴增產物泄漏，這種熒光定量PCR儀極易導致氣溶膠污染。
3．選擇帶UNG酶防污染體系和內參的熒光定量PCR試劑盒
科學的試劑盒會引入UNG酶防污染體系，同時通過產品設計，保證PCR擴增效率。在降低氣溶膠污染同時，保證檢測的敏感性。
在熒光定量PCR擴增原料中不加TTP，只加UTP，擴增產物是含有UTP的核酸片段。UNG酶可以水解含有UTP的核酸片段，在擴增程序前添加UNG酶反應程序，可水解反應體系中含UTP的擴增產物，然后使用95℃高溫滅活UNG酶，再運行熒光定量PCR反應程序，可以大幅度降低擴增產物氣溶膠污染。
某些試劑盒附帶的陽性對照濃度非常高（Ct值
使用帶內參的熒光定量PCR試劑盒監控每個反應是否正常；使用弱陽性的樣本（27
4. 熒光定量PCR應和普通PCR進行分區管理
某些檢測中心針對相同的傳染病檢測，可能既開展熒光定量PCR檢測，又開展普通PCR檢測。如果普通PCR的擴增片段覆蓋熒光定量PCR反應的擴增片段，則普通PCR的擴增產物極易污染熒光定量PCR檢測系統。
5. 規范設計，改善PCR實驗室環境
標準PCR實驗室通常分為四個區（熒光定量PCR實驗室無需產物分析區，分三個區），不同區域執行不同的實驗操作（表1），中間品通過雙扉傳遞窗單向傳遞。不同區域之間空氣互相不流通，使用空調凈化系統控制不同區域氣壓，形成壓差，控制空氣流向。每個區域設置緩沖間，緩沖間外部設置PCR實驗室專用走廊（圖1）。
表1 PCR實驗室不同區域劃分及功能特點
圖1 PCR實驗室平面布局示意圖
注：四個獨立工作區，從試劑配制區到產物分析區空氣壓力逐步降低；試劑配制區和樣本處理區是正壓室，外開門設計，保證外面的空氣不進入；核酸擴增區和產物分析區是負壓室，內開門設計，防止里面的空氣溢出。
目前很多集團公司中心實驗室裝修設計越來越規范，但是區域實驗室和臨床實驗室大多條件相對簡陋，很難達到標準實驗室要求。建議基層實驗室在布局時，盡可能分三個房間設置不同功能區，如果做不到空氣凈化和壓差控制，則每個房間應安裝排氣扇，及時通風。
專家點評
點評專家：王長年
非洲豬瘟背景下，豬場的生物安全風險(包括豬場人員流動、物品流動和豬只流動等)的監測評估、精準清除、引種(包括引入種豬和/或引入公豬精液等)都離不開實驗室的檢測，尤其是PCR實驗室的檢測。精準檢測也逐漸成為各養豬企業的核心競爭力之一。
PCR實驗室在檢測非洲豬瘟病毒核酸的過程中常見一些假陽性結果， 而這些錯誤的信息又會給豬場相關管理人員帶來極大的心理和工作壓力。本文作者就非洲豬瘟PCR檢測過程中經常出現的假陽性結果的主因(如樣本的采集、運輸、保存和處理、陽性對照、試劑盒生產廠家、與之配套的儀器設備等)進行分析，對如何減少和避免假陽性結果發生(如人員培訓、儀器配套、內參設置等)以及在實驗室建設方面進行科學、合理、規范化的設計(如分區設置、通風處理)等多方面內容進行介紹，非常適合廣大基層PCR實驗室作為參考。
編輯：河北方田 馮亞敏 審閱：仇華吉
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